马克西米连的长子勃艮第公爵菲利普一世娶了卡斯蒂亚女王伊莎贝拉和阿拉贡国王斐迪南二世的独生女胡安娜， 于是菲利普一世死后， 查理五世于1506年继承了勃艮第公爵头衔，获取今比利时、荷兰的领地。 1516年，他继承了他外祖父斐迪南二世的阿拉贡国王，巴塞罗那伯爵、瓦伦西亚国王、那不勒斯国王、西西里国王头衔。 同年，他又从其母胡安娜那里,继承了卡斯蒂亚国王头衔。 1519年，马克西米连一世去世，查理五世被选为德意志国王，并继承了其祖父的奥地利大公、斯蒂利亚公爵、卡林提亚公爵、 卡尼奥拉公爵、提罗尔伯爵头衔。1520年，他加冕为神圣罗马帝国皇帝。 查理五世在位期间，是哈布斯堡王朝最鼎盛的时期，但同时内忧外患不断。 他在位期间，从德国暴发的马丁路德的新教革命席卷了整个欧洲， 并赢得了合法地位.。1521-1553年，查理五世和法王弗朗索瓦一世为了西班牙在意大利的领地进行了五次大规模的战争，最终确保了西班牙在意大利的统治.。1526年奥斯曼帝国的苏莱曼大帝征服了匈牙利，匈牙利王路易二世败死，1529和1533年，苏莱曼大帝两次攻打维也纳，查理五世的弟弟奥地利大公斐迪南一世不得不对奥斯曼帝国称臣。 此后哈布斯堡王朝始终处于奥斯曼帝国的威胁之下，直到1571的勒班托海战，查理五世的私生子约翰终于打败土耳其人，解除了奥斯曼帝国的威胁。
