来源：SCH通讯

一、研究目的：

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）是苯乙胺类和安非他明类中枢神经系统兴奋剂，常被作为消遣性药物（毒品）使用。近年赖滥用MA的情况在青少年中越来越常见，这已经成为一个严重的公共卫生问题。

MA滥用除了会引起严重的神经退行性变、增加脑血管意外风险之外，对生殖系统也有很强的毒性。它破坏下丘脑-垂体-睾丸轴的功能，降低促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平，破坏精子功能和睾丸结构，对男性生育能力产生负面影响。除此之外。对交配前、妊娠和哺乳期雌鼠进行MA注射还会出现生理学和行为学方面的负面影响。此外在人类女性中还导致月经周期的中断和下丘脑-垂体-卵巢轴的功能障碍。

与其他成瘾药物相似，多项研究表明氧化应激和线粒体损伤可能在MA诱导的遗传毒性和细胞凋亡中发挥重要作用。这种细胞毒性和遗传毒性可能加速生殖老化。然而，MA对年轻女性生育能力的潜在不利影响尚未被仔细研究。

人们普遍认为卵巢滤泡衰竭是不可逆转的。因此，评价卵巢储备和卵泡衰竭的情况对女性生育期的长短的评估具有重要意义。抗苗勒管激素（Anti-Mullerian hormone，AMH）是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族的一员，由窦前卵泡和小的窦卵泡颗粒细胞产生。它对原始卵泡募集以及生长卵泡对卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）的反应有抑制作用，因此被认为是卵巢储备功能的理想标记物。除了AMH，卵巢卵泡计数也是评价卵巢储备功能的一个重要指标。

尽管青少年接触MA的情况越来越普遍，关于早期接触MA对女性生育能力和卵巢储备能力的长期影响的研究却很少。因此本研究的目的是探索有着长期MA暴露史的青少年在成年后生育能力和卵巢储备能力的情况。研究者提出假设：青少年女性的MA滥用会在成年后影响卵巢储备功能和生殖能力。

二、研究方法：

建立一个女性青春期MA滥用的小鼠模型，从形态学、组织学、生化、激素和行为学多个方面进行评估（图1）。

图1

（1）女性青春期MA滥用小鼠模型的建立

将ICR雌性小鼠置于21±2℃、55±5%湿度、昼夜周期为12:12 h的环境中养育。用剂量5 mg/kg的MA或0.9%生理盐水经腹腔注射给药（n = 24）。从出生后第21天开始，每周连续3天，每天1次，连续8周。这种注射模式模拟了人类在周末消耗MA的模式。

（2）形态学研究：

① 用透射式电子显微镜对卵巢颗粒细胞进行超微结构观察，步骤如下：卵巢切片-固定-梯度脱水-修块-超微切片-染色-观察-拍照。

② 用光学显微镜对颗粒细胞进行形态学观察：采用传统的机械方法从卵巢中分离颗粒细胞。细胞以1×105个/孔的密度被被接种在6孔板中。在37℃，5% CO2的培养箱中培养2天。光镜下观察颗粒细胞形态。

（3）分子生物学研究：Western blot

步骤：蛋白抽提-蛋白定量-蛋白变性-制胶-上样电泳-转膜-染色-封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育-洗膜-曝光-数据分析。

以β-actin作为内参，检测AMH、AMHR2、BAX、Bcl-2的蛋白表达量。

（4）组织学研究：滤泡计数

① HE切片制作：石蜡包块包埋卵巢组织-切片-HE染色

② 滤泡计数：在光镜下，从卵巢中心的最大横截面开始，在3个连续切片中对每个发育阶段的卵泡进行计数，计算平均值。切片厚度为5μm，间隔为25μm。为了避免重复计数，只对含有卵母细胞核的卵泡进行计数。根据Myers et al.（2004）对卵泡进行分类。计算每只小鼠各切片中不同卵泡的平均数目。整个过程由2个技术人员各自计数2次。

（5）卵巢功能研究：激素测量

颗粒细胞在37℃，5% CO2的培养箱中培养2天后，离心收集上清用ELISA检测AMH、雌激素和孕酮的浓度。

（6）行为学研究：发情周期、交配能力、产仔数和后代体重的测定

MA处理结束2周后，通过阴道涂片灌洗检查雌鼠是否改变了发情周期的规律和持续时间。当发情周期短于4天或长于5天被认为是不规律的。

动物每隔一天可以交配一次。两只雌鼠和一只未经处理的雄鼠被关在每个笼子里。第二天早上若在雌鼠身上观察到到精子栓的存在，则证实了交配的成功。

幼崽出生时计算产仔数并称量体重。

（7）统计学分析

使用SPSS 13.0软件包进行统计分析。使用单向方差分析对蛋白质表达、卵泡计数、激素水平、周期天数、产仔数和幼崽的重量进行统计比较，用平均值±标准差表示。用卡方检验对不规则的小鼠雌激素周期进行统计比较。p